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    IHC

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    免疫组化常见问题原因分析

    问题

    可能原因

    验证或解决办法

     

     

     

     

     

     

     

     

    无染色

    一抗和二抗不匹配

    使用针对一抗的二抗(如一抗来自兔,二抗为抗兔抗体)

    没有足够的一抗与目标蛋白结合

    使用低稀释度抗体。延长4℃孵育时间(如过夜)。

    抗体的天然结构(3D形态)受损不适用于IHC

    用天然(非变性的)WB法检测抗体,确保抗体没被损坏。

    由于不当储存、稀释或反复冻融造成一抗/二抗试剂盒失效

    做阳性对照确认一抗/二抗试剂盒的有效性。

    靶组织中没有目标蛋白

    参照抗体供应商的建议做阳性对照。

    组织中没有足够的目标蛋白

    应用信号放大操作。

    没有避光保存二抗

    避免将二抗处于光照下

    脱蜡不彻底

    延长脱蜡时间,更换二甲苯。

    固定步骤(使用福尔马林和多聚甲醛固定剂)修饰了抗体识别表位

    抗原修复法暴露出抗原表位,缩短固定时间。

    蛋白位于细胞核内(核蛋白),抗体不能穿透核膜

    在封闭液和抗体稀释液中加入通透剂。

    PBS缓冲液被细菌污染后破坏了靶蛋白的磷酸根

    在抗体PBS储存液中加入0.01%叠氮化合物,或使用新鲜无菌的PBS。

     

     

     

     

     

     

     

     

    高背景

    没有封闭非特异性结合或封闭不充分

    延长封闭时间,并考虑改换封闭剂。建议用10%正常血清封闭切片1小时或1-5% BSA封闭培养细胞30分钟。

    一抗浓度过高

    滴定法寻找到最佳抗体浓度,或在浓度较低抗体中延长孵育时间(最好是缓慢而准确地结合)。

    孵育温度过高

    4°C孵育切片或细胞。

    二抗发生了非特异性结合(被损坏)

    不加一抗,做二抗对照。

    组织冲洗不彻底,有固定剂残留

    所有步骤都要用PBS充分洗涤。

    存在内源性过氧化物酶活性

    用酶抑制剂如抑制碱性磷酸酶的盐酸左旋咪唑(2mM),或抑制过氧化物酶的H2O2(0.3% v/v)。

    固定过度(固定剂用福尔马林和多聚甲醛)导致抗体识别抗原位点被修饰

    改变抗原修复方法,缩短与抗原修复液的孵育时间。

    信号过度放大(信号放大技术)

    缩短信号放大孵育时间,稀释信号扩大试剂盒。

    染料与PBS在细胞/组织中相互作用(酶检测法)

    用Tris缓冲液冲洗切片后,再与底物孵育。孵育后,Tris缓冲液再次冲洗细胞/切片。

    通透作用破坏膜并除去了膜蛋白

    去除缓冲液中的通透剂

    底物过量(酶检测法)

    缩短底物孵育时间

     

     

     

    非特异性染色

    一抗/二抗浓度过高

    降低抗体浓度和或缩短孵育周期。对比不表达目标蛋白细胞的信号强度。

    存在内源性过氧化物酶活性

    用酶抑制剂如抑制碱性磷酸酶的盐酸左旋咪唑(2mM),或抑制过氧化物酶的H2O2(0.3% v/v)。

    一抗与被染组织同源(如用鼠一抗测鼠组织),加二抗后,二抗会与同源的所有组织结合

    应用与组织非同源的一抗

    切片/细胞变干

    保持切片/细胞湿度,切勿变干。

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