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    免疫组化常见抗原修复方法

          大多数甲醛固定的组织在开始染色之前都需要先修复抗原,这是由于在固定过程中产生了亚甲基桥使蛋白之间交联屏蔽了抗原位点。两种抗原修复方法为热修复法(称之为热诱导抗原表位修复或HIER)和酶解法。

    一、热修复法

    1. 热修复缓冲溶液

    下面是三种HIER较为常用的缓冲溶液,对于一个特定的抗体,在没有其他研究者建议的情况下,要通过实验确定选用哪种修复缓冲液。

    1)  枸橼酸钠缓冲液(10 mM Sodium Citrate,0.05% 吐温- 20, pH 6.0)

    2) 1 mM EDTA, 调至pH 8.0

    3) Tris/EDTA 缓冲液(10mM Tris, 1 mM EDTA 溶液, 0.05% 吐温-20, pH 9.0)

    2. 热修复方法

    a) 高压蒸汽法

    玻片要置于金属架上

    1)材料及试剂

    • 家用不锈钢高压锅

    • 加热板

    • 玻片架放置容器(容量大约400-500ml)

    • 抗原修复缓冲液(如Tris/EDTA pH 9.0,枸橼酸钠pH 6.0)

    2)方法

    1. 将合适的抗原修复缓冲液加入高压锅内,然后将锅置于加热板并开至最大功率,此时不要把盖子盖紧。在等待煮沸过程中,进行脱蜡至水。

    2.煮沸后,将玻片从自来水中取出放入高压锅内。小心热溶液- 使用镊子。依照说明书加上加压阀。

    3.高压锅达到最大压力后,维持3分钟。

    4.3分钟过后,关掉加热板,将高压锅取下放置。

    5.打开高压锅阀门,冷水冷却锅身。压力降下后,打开锅盖,冷水冷却10分钟。

    6.继续染色。

    b) 微波法

    1)材料和试剂

    • 家用(850W)或科研专用微波炉

    • 微波炉专用玻片放置架及容器(容量大约400-500ml)或染色缸

    • 抗原修复缓冲液(如Tris/EDTA pH 9.0,枸橼酸钠溶液pH 6.0,等等)

    2)方法

    1.将切片脱蜡至水。

    2.向微波炉专用容器中加入合适的修复缓冲液。

    3.从自来水中取出切片并放入容器中,置于微波炉内。如果用家用微波炉,就将之开到最大功率至开始沸腾并煮沸20分钟。如果采用科研专用微波炉,就将温度设置在98°C维持20分钟以修复抗原。

    4.20分钟后,取出容器放置水中冷却10分钟。小心热溶液。

    5.继续染色。

     

    c) 蒸煮锅法

    1)材料和试剂

    • 蒸煮锅

    • 玻片放置架及容器(容量大约400-500ml,如果采用Tissue–Tek容器大约250ml)

    • 抗原修复缓冲液(如Tris/EDTA pH 9.0,枸橼酸钠溶液pH 6.0,等等)

    2)方法

    1.将切片脱蜡至水。

    2.依据用户手册设置蒸煮锅并预热。

    3.在烧瓶中加热适量修复缓冲液并煮沸。

    4.将盛放玻片架的容器放置蒸煮锅中。

    5.将热修复缓冲液小心加到容器中,然后放入玻片架。也可以采用更简捷的操作,先向容器中加热修复缓冲液再放入蒸煮锅中。

    6.加盖。盛放缓冲液的容器也须配备盖子。刚开始时玻片架可能会使修复溶液温度降低,但几分钟内会回升到95-100°C之间。

    7.达到温度后维持20分钟。

    8.20分钟后,取出容器放置水中冷却10分钟。

    9.组织染色。

     

    二.酶解抗原修复法

     a)滴管法

    1)材料和试剂

    • 37°C孵育箱

    • 加湿器(恒温箱自带或在容器内放入湿纸巾)

    • 两个盛TBS的玻片架容器

    • 酶解抗原修复溶液(如胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K,等等)

    2)方法

    1.将胰蛋白酶预热至37°C。小心的将组织切片周围的水吸干,然后吸取酶溶液滴加到切片上(一般50-100µl即可)。用吸管尖端将酶溶液铺盖住整个切片,注意不要弄坏组织。

    2.将玻片置于加湿器内,然后37°C孵育。避免直接将玻片放入恒温箱架子上,否则会因温度不均影响染色质量。盛放玻片的容器最好先预热再放入恒温箱内。

    3.10-20分钟(需要优化)后,取出玻片,流水冲洗3分钟。

    4.继续染色。

     

    b) 侵泡法

    1)材料和试剂

    • 37°C 水浴

    • 玻片架及玻片架容器

    • 酶解抗原修复溶液

    2)方法

    1.将水浴温度设置为酶最适宜的温度。向盛放玻片架的两个容器中加入超纯水。容器放入水浴中加热。

    2.按上述方法将切片脱蜡至水后放入水浴箱其中一个容器中加热。

    3.用水浴箱中另一个容器中的热水制备酶解抗原修复缓冲液,然后将盛有缓冲液的容器放回水浴箱中重新加热。

    4.将加热过的玻片放入酶溶液中10-20分钟并间歇缓慢震荡。取出玻片在流水下冲洗3分钟,将酶漂洗干净。

    5.继续染色。

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